化橘红中黄酮类化合物提取及测定方法的研究进展
摘要： 黄酮类化合物是化橘红的主要活性成分，主要包含柚皮苷和野漆树苷。本文对近年来化橘红中黄酮类化合物的提取和含量测定的常见方法进行了概述，为化橘红质量控制指标快速提取和测定方法提供理论依据。
关键词： 化橘红；黄酮类成分；提取；含量测定
0 引言
化橘红（Exocarpium citri Grandis）又名“化州橘红”、“化州陈皮”、“柚皮橘红”等，为芸香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮。化橘红有散寒、燥湿、消痰、利气等功效。化橘红主要有效成分是黄酮类化合物，其中最主要是柚皮苷和野漆树苷，二者含量之和占化橘红黄酮类物质总量的84%以上。因此，在现有的质量控制标准（主要参考DB 44/T 615-2009《地理标志产品 化橘红》和《中国药典》）中，把“总黄酮含量、柚皮苷含量和野漆树苷含量”3个指标作为化橘红的关键质量控制指标。笔者所在单位是化橘红原产地（广东化州）的食品药品法定监督检测单位，须按质量控制方法对本地化橘红生产企业生产的化橘红产品进行监督检测。但现有质量控制方法须在不同条件下分别提取和测定总黄酮含量、柚皮苷含量和野漆树苷含量，工作效率较低。本文综述了化橘红中黄酮类化合物的提取及测定方法的研究进展，旨在探寻化橘红中黄酮类化合物的同时提取和同时测定的快速方法，以期提高检测效率和监督效果。如图1～3。
1 化橘红中黄酮类化合物的提取方法
1.1 索氏提取法
该法利用黄酮类化合物在有机溶剂中溶解度较大的原理，直接从化橘红中萃取黄酮类化合物。索氏提取器用有机溶剂将固体样品长期反复浸润而将所需要的物质浸出来，即长期浸出法。根据黄酮化合物和其杂质的极性不同，可选用适合的有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙醚、石油醚等。索氏提取法可以提取出大多数游离的黄酮类化合物，但该法操作繁琐，所需时间较长。
1.2 超声波提取法
超声波提取法是一种新的提取分离技术。该法利用超声波的空化作用，强烈震动搅拌作用，热力作用等与传统溶剂萃取法相结合的原理。当空化作用产生时，在固/液非均相体系的接口发生气泡爆破，破坏植物的细胞壁，再加上碰撞次数增多、物质交换次数也就增多，细胞膜的透过能力得到增强，加速黄酮类化合物进入到溶剂，增强物质在溶剂中的溶解能力，从而提高提取率，缩短提取时间。此法操作简便，所需时间较少，提取效率高。
1.3 方法对比与讨论
在现有的质量控制方法中，化橘红的3个质量控制指标，总黄酮含量和柚皮苷含量提取使用的是索氏提取法，野漆树苷含量提取使用的是超声波提取法。两种方法对比，索氏提取法处理样品需用时8.5h，超声波提取法只需1.5h，超声波提取法具有省时、操作简便、提取效率高等优点，亦可考虑应用于化橘红中总黄酮含量和柚皮苷含量测定的样品处理。陈永刚等对超声波提取法与索氏提取法进行了比较研究。试验表明，超声波提取法同样适用于化橘红中总黄酮含量和柚皮苷含量测定的样品处理。因此，化橘红的3个质量控制指标的测定均可用超声波提取法进行样品处理，只需进行一次提取所得样品液便可用于3个指标的测定，大大缩短了样品处理时间。如表1所示。
2 化橘红中黄酮类化合物的测定方法
2.1 紫外可见分光光度法（UV）
黄酮类化合物分子中具有3-羟基、5-羟基或邻二酚羟基，易于与Al（NO3）3，AlCl3等金属盐类反应，生成有色金属络合物，这些络合物作用在光谱上能产生明显的变化，吸收峰红移。DB 44/T 615-2009《地理标志产品 化橘红》以此法测定总黄酮含量，根据黄酮类化合物可与铝盐反应显色的原理，以柚皮苷为对照，提取样品液与硝酸铝显色后在384nm处测定吸光度，从而测得化橘红的总黄酮含量。实验结果显示，该法具有设备简单、适用性广、准确度和精密度较好等特点，已在总黄酮含量分析中发挥着重要作用。
2.2 薄层色谱法（TLC）
薄层色谱法（TLC）是一种吸附薄层色谱分离法，利用混合物各组分在某一物质中的吸附或者分配等性能不同，使样品液中各种物质进行反复的吸附或者分配等作用，从而达到混合物各组分互相分离的目的。2003年8月袁旭江等建立了测定化橘红野漆树苷含量的薄层扫描法，实验结果表明，该方法简便可行，灵敏度较高，适用于化橘红中野漆树苷含量测定。DB 44/T 615-2009《地理标志产品 化橘红》中，TLC法用于化橘红的品种鉴别。
2.3 高效液相色谱法（HPLC）
高效液相色谱法（HPLC）将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。HPLC法速度快，效率高，检测灵敏度高，适合大分子，高沸点，强极性，热稳定性差的化合物的分离分析。 DB 44/T 615-2009《地理标志产品 化橘红》以HPLC法测定野漆树苷的含量，《中国药典》亦以此法测定柚皮苷含量，DB 44/T 615-2009《地理标志产品 化橘红》中柚皮苷含量测定引用《中国药典》方法。HPLC法测定柚皮苷和野漆树苷均用DAD检测器，但仍需分别测定，因为二者的检测波长不一样，柚皮苷检测波长为283nm，野漆树苷为345nm。刘晓涵等建立了HPLC法同时测定化橘红中柚皮苷和野漆树苷含量的方法，通过梯度洗脱方式在330nm下同时测定柚皮苷和野漆树苷含量，为制定该药材质量的快速检测方法提供参考。
2.4 高效液相色谱-质谱联用法（HPLC/MS）
该法利用了高效液相色谱对复杂化合物的高效分析能力以及质谱的高灵敏度。高效液相色谱（HPLC）能够有效地将有机物待测样品中的有机物成分分离开，而质谱（MS）能够对分开的有机物逐个的分析，得到有机物分子量，结构和浓度等信息。与传统的HPLC、TLC等方法相比，HPLC/MS不需复杂的样品制备过程，并且具有快速、精确、灵敏度高等优点。高效液相色谱-质谱联用技术广泛用于定性定量分析柑橘类化合物及其提取物中的黄酮类成分。刘群娣等采用HPLC-DAD-MS/MS进行了化橘红的成分分析，确定或推测出化橘红中的一些主要成分，其中多为黄酮类和香豆素类化合物。并获得了黄酮类及香豆素类化学物丰富的结构信息，为化橘红化学成分的定性定量提供了一种快速有效的方法。
2.5 方法对比与讨论
黄酮类化合物检测方法从单一的分光光度法发展到薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法等方法。在实际工作中，紫外分光光度法的专属性较差，主要用于对总黄酮的测定。薄层色谱法曾用于化橘红中黄酮单体含量的定量分析，但现在大多被高效液相色谱法所代替，该法目前主要用于化橘红的品种鉴定。高效液相色谱法适用于黄酮单体含量的测定，DB 44/T 615-2009《地理标志产品 化橘红》和《中国药典》均以此法测定化橘红中柚皮苷和野漆树苷含量。高效液相色谱-质谱联用法不仅用于化橘红黄酮类化合物的定性定量分析，还可提供黄酮类化学物丰富的结构信息，具有强大的组分鉴定能力。
3 总结与展望
综上所述，针对化橘红的3个质量控制指标：总黄酮含量、柚皮苷含量和野漆树苷含量，样品处理可以同时进行，只需用超声波提取法进行一次提取，所得样品液即可用于以上3个指标的测定。测定方法方面，总黄酮含量使用紫外可见分光光度法，柚皮苷和野漆树苷含量用HPLC法，通过梯度洗脱方式在330nm下可同时测定。以上提取及测定方法与现有质量控制方法相比，提取时间缩短了80%，试剂用量减少了70%，测定时间缩短了30%，大大提高检测工作效率和监督效果。如表2所示。
针对化橘红中全成分多指标同时检测的快速高效分析方法会成为今后研究热点，随着科技的发展与学科的交叉，高效液相色谱-质谱联用法以其灵敏度高和检测结果信息丰富方面的优势，将会成为化橘红中黄酮类化合物的重要测定方法。
参考文献：
[1]陈永刚，林励，等.超声波提取法与索氏提取法提取化橘红柚皮苷的比较研究[J].中药新药与临床药理，2008，19（4）：309-311.
[2]刘群娣，谢春燕，等.化橘红化学成分的HPLC-DAD-MS-MS分析[J].世界科学技术：中医药现代化，2011，13（5）：864-867.
[3]刘晓涵，陈永刚，等.化橘红中柚皮苷和野漆树苷含量同时测定方法的建立[J].中药新药与临床药理，2010，21（6）：640-642.
参考：
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